不同物种TYR基因编码蛋白结构及功能的生物信息学分析
摘要：利用生物信息学方法对13個物种TYR基因编码蛋白的理化性质，以及一级、二级、三级结构和亚细胞定位进行预测和分析，同时拟构建13个物种TYR基因的系统发育树。结果表明：TYR基因编码产物为不稳定蛋白（貉子除外），整条多肽链表现出亲水性。二级结构主要为α螺旋、β折叠，β转角区域分布少且散，均存在信号肽和跨膜区，可以判断TYR基因编码蛋白是定位于生物膜上的膜蛋白或分泌蛋白，主要在嘌呤和嘧啶、运输和结合、电压门控离子通道及转录中发挥作用。各物种TYR基因编码产物主要定位于内质网、高尔基体以及细胞质膜。除原鸡外，其他物种该蛋白均存在跨膜区，貉子有2个跨膜区域。各物种系统发育树与动物学进化观点基本一致。
关键词：物种；酪氨酸酶基因；毛色；蛋白质结构；生物信息学
中图分类号： Q754文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）21-0044-05[
[HJ14mm]
收稿日期：2016-06-01
基金项目：河北省高校创新团队领军人才培育计划（编号：LJRC004）；河北省应用基础研究计划重点基础研究项目（编号：15962901D）；河北省自然科学基金重点项目（编号：C2016407114）。
作者简介：郭敏（1991—），女，内蒙古呼和浩特人，硕士研究生，研究方向为功能基因组学。E-mail：1908384796@qqcom。
通信作者：李祥龙，博士，教授，博士生导师，研究方向为动物遗传育种。E-mail：lixianglongcn@yahoocom。
动物的毛色、羽色不但可以作为质量性状，也可作为一种经济性状被利用。目前，绿色、环保、优质的毛皮产品已成为广大消费者追求的目标。毛色表型主要受黑色素的影响，是黑色素在毛皮质和髓质中沉淀的种类和数量不同造成的。研究表明，动物毛色的形成主要与黑色素细胞中合成的2种色素（真黑色素、褐黑色素）比例有关。真黑色素通常可使皮肤或毛皮表现为褐色、黑色，褐黑色素能使皮肤或毛皮表现为黄色、红棕色[1]，黑色素沉淀取决于这2种色素的相对含量。对于动物黑色素细胞而言，酪氨酸酶（tyrosinase，简称TYR）作为关键酶参与黑色素的合成[2]，具有加氧酶、脱氢酶双重功能[3]，动物黑色素的形成主要遵循多巴（DOPA）途径，指在动物体内，酪氨酸在TYR的催化作用下，经由DOPA、多巴醌、吲哚醌等形式，最后生成黑色素。酪氨酸酶相关蛋白酶1（TYRP1）、酪氨酸酶相关蛋白酶2（TYRP2）与酪氨酸酶（TYR）构成了酪氨酸酶基因家族，TYRP1、TYRP2各自催化特异的反应参与黑色素的合成，这3种成员协同调控黑色素的形成[4]，并且与其他毛色相关基因共同作用调控毛色的形成。引起黑色素代谢紊乱的主要原因是TYR基因突变或酶的失活，最终将导致机体组织异常表达[5]。有研究表明，哺乳动物TYR基因包含5个外显子和4个内含子，序列长度约为16 kb[6]。本研究选用GenBank中已提交物种的TYR基因编码蛋白序列，利用生物信息学方法对TYR基因编码蛋白的结构与功能进行预测和分析，以期研究TYR基因及其编码蛋白的功能，进而为该基因调控的动物毛色机制研究奠定基础。
1材料与方法
11序列来源
[JP2]从美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站（http：wwwncbinlmnihgov）的GenBank中下载包括斑马鱼、犬、东北虎、家兔、[JP3]家猫、绵羊、貉子、家牛、人、狨猴、原鸡、中央蝙蝠、家猪等13个物种的TYR基因编码蛋白序列[7]。序列来源见表1。
12蛋白结构分析
121一级结构利用Expasy开发的针对蛋白质基本理化性质的Protparam工具（http：wwwexpasyorgtoolsprotparamhtml）分析TYR基因编码蛋白序列的相对分子质量、氨基酸组成、等电点（pI）、消光系数、半衰期、不稳定系数、总平均亲水性等。同时通过 Expasy开发的Protscale工具对TYR基因编码的蛋白质进行亲水性、疏水性分析。利用TMHMM Server v20在线软件（http：wwwcbsdtudkservicesTMHMM-20）预测跨膜区[8-9]。
122二级结构利用Chou & Fasman Secondary Structure Prediction Server软件预测TYR基因所编码蛋白质的α螺旋、β折叠和β转角。同时，分别使用Protfun 22 Server[10-11]、Signal P 41 Server[12]在线软件分析预测TYR基因编码产物的功能分类和信号肽。
123亚细胞定位利用PSORT Ⅱ Prediction在线软件（http：psorthgcjpform2html）对TYR基因编码蛋白在细胞内的位置进行定位与分析[13]。
13构建系统发育树
应用DNAMAN软件对不同物种TYR基因编码蛋白序列进行多序列比对并构建系统发育树[14]。
2结果与分析
21不同物种TYR基因编码蛋白的一级结构
211蛋白质理化性质由表2可知，13个物种TYR基因编码蛋白的氨基酸组成相同，且亮氨酸（Leu）、丝氨酸（Ser）含量明显高于其他氨基酸。表3为13个物种TYR基因编码蛋白的理化参数，包括氨基酸数量、相对分子质量、pI值、分子式、原子总数、正电荷残基数负电荷残基数、不稳定指数、脂肪系数和亲水性总平均值等。可以看出，脂肪系数均高达70以上，其中貉子的脂肪系数最高，达到8139；亲水性总平均值表现为负值，说明这13个物种TYR基因编码的蛋白均为亲水蛋白；除貉子（不稳定指数<40，稳定）外，其他物种TYR基因编码的蛋白均为不稳定蛋白质。
212跨膜区分析通过软件分析可知：貉子TYR基因编码产物有2个跨膜区域，原鸡TYR基因编码产物无跨膜区域，第1～499 aa位于胞外。对13个物种进行跨膜区预测结果显示，除原鸡外，其他物种该蛋白均存在跨膜区（表4），揭示该蛋白是定位于生物膜的跨膜蛋白。
22不同物种TYR基因编码蛋白的二级结构
221α-螺旋、β-折叠、β-转角的预测经过软件分析可知：在各物种TYR基因编码蛋白的二级结构中，α-螺旋、β-折叠区域分布较广，而β-转角区域分布少且较分散（表5）。
222信号肽的预测通过分析蛋白序列有无信号肽，可以判断此蛋白是否为分泌蛋白[15]。表6的预测结果显示，原始剪切位点分值（raw cleavage site score，简称C值）的最大值与被结合的剪切位点的分值（combined cleavage site score，简称Y值）的最大值均趋向于+1，信号肽分值（signal peptide score，简称S值）的最大值在切割位点前高，在切割位点后低，符合信号肽的标准，可以判断TYR基因编码产物中存在信号肽。
223亲水性与疏水性的预测亲水性氨基酸一般位于蛋白分子表面，而疏水性氨基酸位于蛋白质分子的内部[16]。氨基酸的亲水、疏水性可以用来判断蛋白质折叠的大致趋势。对13个物种TYR氨基酸序列的亲水、疏水性进行预测，正值
表疏水，负值表亲水；正值越大表示疏水性越强，负值越小表示亲水性越强，表7结果显示，13个物种整条多肽链均表现亲水性，因此认为，TYR基因编码产物为亲水蛋白，且位于蛋白质分子表面。
23不同物种TYR基因编码蛋白的亚细胞定位
如表9所示，各物种TYR基因编码产物主要定位于内质网、高尔基体以及细胞质膜，其中人的该基因编码产物有小部分定位于细胞外（111%），而原鸡的该基因编码产物主要定位于细胞外，比例高达667%，小部分定位于内质网、高尔基体及液泡中，且比例均为111%。
24不同物种TYR基因编码蛋白的三级结构
对不同物种TYR基因编码蛋白的三维结构进行同源建模，结果表明，各物种蛋白结构丰富多样，存在大量折叠、螺旋扭曲，这些特点对物种的生物学功能具有重大意义。
25系统发育树
3结论
不同物种TYR基因编码蛋白脂肪系数均高达70以上，其中貉子最高，达到8139。除貉子外，其他物种TYR基因编码蛋白均为不稳定蛋白质，整条多肽链表现亲水性。除原鸡外，其他物种该蛋白均存在跨膜区，貉子有2个跨膜区域，揭示该蛋白是定位于生物膜的跨膜蛋白。
TYR基因编码蛋白的二级结构主要为α螺旋、β折叠，β转角区域分布少且散，均存在信号肽、跨膜区，主要在嘌呤和嘧啶、运输和结合、电压门控离子通道及转录中发挥作用。各物种TYR基因编码产物主要定位于内质网、高尔基体以及细胞质膜，人有小部分定位于细胞外（111%），而原鸡主要定位于细胞外（667%），小部分定位于内质网、高尔基体及液泡中（111%）。系统发育树分析结果符合动物学进化观点。
[FK（W14][TPGM1tif]
参考文献：
[1][ZK（#]Ito S，Wakamatsu K，Oeki H Chemical analysis of melanins and its application to the study of the regulation of melanogenesis[J] Pigment Cell Research，2000，13（8）：103-109
[2]Hearing V J，Tsukamoto K Enzymatic control of pigmentation in mammals[J] FASEB J，1991，5（14）：2902-2909
[3]Crippa R，Horak V，Prota G，et al Chemistry of melanins[J] The Alkaloids，1989，36：253-323
[4]Jimbow K Biological role of tyrosinase-related protein and its relevance to pigmentary disorders （Vitiligo vulgaris）[J] Dermatol，1999，26（11）：734-737
[5]Aigner B，Besenfelder U，Seregi J，et al Expression of the murine wild-type tyrosiness gene in transgenic rabbits[J] Transgenic Res，1996，5（6）：405-411
[6]Oetting W S The tyrosinase gene and oculocutaneous albinism type 1（OCA1）：a model for understanding the molecular biology of melanin formation[J] Pigment Cell Res，2000，13（5）：320-325
[7]付鑫，李祥龙，周荣艳，等 14个物种RPSA基因编码区生物信息学分析[J] 湖北农业科学，2012，51（2）：389-390
[8]杨洪一，孙立娜，张杰，等 黄瓜绿斑驳花叶病毒抗原表位预测[J] 河南农业科学，2013，42（8）：67-70
[9]胡慧艷，贾青，陶隽，等 家猪TBP蛋白结构与理化性质的生物信息学分析[J] 河南农业科学，2014，43（3）：128-132
[JP2][10][ZK（#]Jensen L J，Gupta R，Blom N，et al Prediction of human protein function form post-translational modification and localization features[J] Journal of Molecular Biology，2002，319（5）：1257-1265
[11]Jensen L J，Gupta R，Strfeldt H H，et al Prediction of human protein function according to Gene Ontology categorise[J] Bioinformatics，2003，19（5）：635-642
[12]李玩生，刘磊，冯海燕，等 猪T细胞受体β链基因的克隆及生物信息学分析[J] 甘肃农业大学学报，2010，45（3）：1-6
[13]Nakai K，Horton P PSORT：A program for detecting sorting signals in protein and predicting their subcellular localization[J] Trends Biochem Sci，1999，24 （1）：34-36
[14]徐小刚，刘雅婷，李永忠，等 番茄斑萎病毒属病毒SRNA序列比对[J] 湖南农业大学学报（自然科学版），2010，36（2）：142-146
[15]Thorton J M From genome to function[J] Science，2001，292（5524）：2095-2097
[16]阎隆飞，孙之荣 蛋白质分子结构[M] 北京：清华大学出版社，1999：221-229