胸水细胞蜡块结合免疫组织化学技术在晚期肺腺癌中的应用
[摘要] 目的 分析胸水细胞蜡块结合免疫组织化学在肺腺癌中的应用。 方法 收集东阳市中医院2008年6月～2015年12月7年间50例可疑恶性胸水样本，分析其临床病史、涂片、细胞蜡块切片、免疫组织化学及基因检测等资料。 结果 50例可疑恶性胸水患者，增生反应性间皮细胞4例，确诊恶性肿瘤46例，其中肺腺癌27例，其他组织来源及组织类型19例，与细胞学常规涂片相比，细胞蜡块切片镜下可见背景干净，染色对比清晰，细胞数目明显增多、厚薄均匀，且可以寻找组织来源及基因检测。 结论 细胞蜡块结合免疫组织化学技术极大地提高了胸水细胞学的诊断准确率及明确组织来源；同时为肿瘤精准医疗提供了平台，值得推广。
[关键词] 胸水；免疫组织化学；腺癌；细胞块
[中图分类号] R734.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2018）19-0135-04
Application of pleural effusion cell wax block combined with immunohistochemistry in advanced lung adenocarcinoma
YU Jiao1 SHI Yongsheng1 GUO Shanshan1 CHEN Yan2
1.Department of Pathology， Dongyang Traditional Chinese Medicine Hospital， Dongyang 322100， China； 2.Department of Pathology， Dongyang People"s Hospital， Dongyang 322100， China
[Abstract] Objective To analyze the application of pleural effusion cell wax block combined with immunohistochemistry in lung adenocarcinoma. Methods 50 cases of suspected malignant pleural effusion from June 2008 to December 2015 were collected from Dongyang Traditional Chinese Hospital. The clinical history， smears， cell wax block， immunohistochemistry and gene detection were analyzed. Results There were 4 cases of proliferative reactive mesothelial cells and 46 cases of diagnosed malignant tumors in 50 cases of suspected malignant pleural effusion. Among them， 27 cases were lung adenocarcinoma and 19 cases were from other tissue sources and tissue types. Compared with that of cytological routine smears， the background of cell wax block was clean under the microscope， and the staining contrast was clear； the number of cells was obviously increased； the thickness was even； the tissue source and gene detection could be found. Conclusion The cell wax immunohistochemistry technique greatly improves the diagnostic accuracy of pleural effusion cytology and clarifies the source of tissue. At the same time， it provides a platform for accurate tumor treatment and is worthy of promotion.
[Key words] Pleural effusion； Immunohistochemistry； Adenocarcinoma； Cell mass
胸水细胞学样本具有可多次重复取得、损伤小、检查时间短等优点，在临床实际工作中较广泛应用于中晚期恶性肿瘤的检查，而普通胸水细胞学涂片很难为临床医师提供恶性肿瘤的发病部位、肿瘤的病理组织学类型、预测预后以及与治疗相关有价值的信息，甚至部分患者难以明确诊断。近年来随着肿瘤精准医疗的不断深入，应用组织病理学样本进行肿瘤基因或免疫组织化学肿瘤蛋白表达的检测，已成为指导临床靶向治疗或预测化疗药物疗效的最可靠方法之一，近年来特别是肺腺癌尤其有临床指导意义，但对于晚期肺腺癌患者，常不容易取得组织病理学样本，相较而言胸水细胞学样本常较容易获得，肺腺癌是导致恶性胸水的最常见原因之一，因此利用胸水细胞学样本进行相应的细胞蜡块诊断及基因检测、免疫组织化学检测，对肺腺癌的诊断、指导临床治疗和预后具有重要意义。本文报告东阳市中医院病理科应用胸水细胞学样本制作细胞蜡块，在此基础上进行免疫组织化学染色、对确诊的晚期肺腺癌患者进行治疗与预后相关的基因检测，探讨胸水细胞学样本制作细胞蜡块行免疫组织化学检测在确定肿瘤组织的来源、肿瘤組织具体类型及肺腺癌患者的治疗及预后的相关基因检测中的应用。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集东阳市中医院2008年6月～2015年12月7年间病理科归档具有常规涂片及细胞蜡块资料的可疑恶性胸水细胞学样本共50例，收集临床病史、涂片、细胞蜡块切片、免疫组织化学及基因检测等资料，其中男29例，女21例，年龄40～79岁，平均（51.0±7.5）岁。
1.2 脱落细胞常规细胞学涂片
送检的新鲜胸水细胞学样本100 mL静置15 min后，倒去上部清亮液体；取10～20 mL瓶底沉渣置于试管2500～3000转/min离心5 min后，将上清液倒去；将剩余细胞学沉渣样物0.5～1 mL用滴管混匀；用滴管吸取混匀的沉淀物滴在载玻片上，均匀涂片后在半潮干状态下用4%甲醛固定10～30 min后常规苏木素-伊红染色；显微镜下仔细观察。
1.3 细胞蜡块操作方法
将胸水脱落细胞学样本常规涂片细胞学检查剩余的细胞学样本移入20～50 mL离心管，2500～3000 转/min，离心10 min，离心沉渣量太少的样本移出上清液，多次重复加入细胞学样本并离心，直到离心沉渣符合制作细胞蜡块要求。离心管内保留上清液1.5～2.5 mL，轻轻混匀，移入专用离心管，色泽较浅的标本可适当滴加伊红试剂染色，静置10 min后，放入水平式离心机1500～2000 转/min，离心5 min（血性细胞学样本，去除红细胞后的离心沉渣仍含有较多血红蛋白，需将离心时间延长1倍）；取出细胞块收集环，细胞混悬液中的细胞成分被收集至细胞块收集环中，形成固定大小形状的固体细胞块，从上部滴加1～2滴琼脂液（已加热至50℃～60℃），室温冷却，连同收集环用脱水纸包裹后放入脱水盒，4%中性甲醛固定液固定6～8 h以上，即可进入脱水机常规脱水处理，常规脱水、透明、浸蜡后包埋，切片行苏木素-伊红染色，免疫组织化学染色等。
1.4 免疫组织化学检测的选择
根据胸水脱落细胞学涂片和胸水细胞蜡块石蜡切片显微镜下观察细胞学及细胞蜡块形态学及临床相关资料选择免疫组织化学抗体，对于临床及影像学可疑肺癌的患者，常规选择AE1/AE3、TTF1、NapsinA、CK7、CK5/6、P63、P40、CEA作为肺癌抗体、选择Calretinin、MC、D2-40、Vimentin作为间皮抗体。以上抗体均购置上海基因科技有限公司。
1.5 免疫组织化学
EnVision二步法，胸水细胞蜡块石蜡切片，脱蜡至水，高压抗原修复10 min，冷却至室温，充分水洗，磷酸盐缓冲液（PBS）浸洗，3 min×3次；去除多余液体，加AE1/AE3、TTF1、NapsinA、CK7、CK5/6、P63、P40、CEA、Calretinin、MC、D2-40、Vimentin等一抗抗体，PBS浸洗，3 min×3次；去除多余液体，滴加通用型二抗-HRP聚合物，37℃，30 min；二氨基联苯胺（DAB）显色2 min，在显微镜下观察显色情况，苏木素复染，0.1%盐酸酒精分化，PBS冲洗返蓝，乙醇脱水、透明、中性树胶封固。
1.6 免疫组织化学判读
根据染色程度和染色细胞百分率进行评定和分析，综合考虑阳性细胞数和染色强度来判定结果，将其中（-）归为阴性表达，（+）～（+++）归为阳性表达。
1.7 肺腺癌治疗与预后相关基因检测
对于经临床病史及免疫组织化学确诊肺腺癌27例中18例送杭州迪安医学检测中心进行表皮生长因子受体（EGFR）基因检测。
2 结果
2.1 细胞学涂片
腺癌细胞明显异型，多形性，核浆比高，核膜厚、不规则，核深染，染色质粗块状，核仁大，有较强的三维立体结构。50例可疑恶性胸水，11例诊断见退变异型细胞，无法明确性质，39例诊断见恶性肿瘤细胞，其中15例倾向腺癌，24例组织类型难定。
2.2细胞蜡块
50例可疑恶性胸水患者，增生反应性间皮细胞4例，确诊恶性肿瘤46例，其中肺腺癌27例，其他组织来源及组织类型19例，与细胞学涂片相比，细胞蜡块制片镜下观察显示背景干净，染色对比清晰，细胞数目明显富集、厚薄均匀，且在多数病例中可观察到细胞的排列方式及组织学结构可见中空的腺样、囊泡状、梁索一乳头状或片状排列的细胞。见封三图5。
2.3 免疫表型
综合HE染色的细胞学涂片、细胞块切片及临床资料，不同的病例选用不同的抗体。肺腺癌病例中CK7、TTF1、NapsinA、CEA至少有两项以上阳性，且Calretinin、CK5/6、D2-40、Vimentin均阴性。见封三图6。
2.4 表皮生长因子受体（EGFR）检测
27例肺腺癌送检18例，其中5例有表皮生长因子受体（EGFR）突变，突变率27.8%。
3 讨论
肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，也是我国最常见的恶性肿瘤之一[1]。相当数量的晚期肺癌患者来院就诊的首发症状为大量恶性胸腔积液，因此对于一些通过临床多种影像学检查等手段均无法明确肺癌诊断的患者在指导治疗、预测预后等方面非常重要。在所有肺癌胸腔转移患者中，绝大多数为肺腺癌所致。传统的胸腔积液检查方法是收集胸腔积液行常规细胞学涂片，显微镜下仅凭借细胞形态学查找肿瘤细胞，但有时因涂片质量欠佳，肿瘤细胞量少，涂片背景血细胞过多，且肿瘤细胞异型性不明显或肿瘤细胞不典型，增生反应性间皮细胞和转移的肺腺癌细胞形态极为相似时，易导致肿瘤的误诊或漏诊[2]。临床实际工作中，鉴别肺转移性肿瘤和间皮性病变具有较大意义，特别是鉴别肺腺癌和恶性间皮瘤常直接影响治疗方案的制定[3]。细胞蜡块因将收集的细胞学样本做成细胞塊石蜡切片而具有组织学的优点，该技术用于免疫组织化学研究胸腔积液不仅有利于明确诊断且可以查找肿瘤原发灶及组织类型[4]。张小伟等[5]利用42例恶性浆膜腔积液标本制作细胞蜡块结合免疫组织化学检查明确组织类型及肿瘤原发病灶40例，其中肺癌29例（腺癌24例、鳞癌3例、小细胞癌2例），其他组织类型及组织来源恶性肿瘤11例。阎红琳等[6]分析53例可疑恶性浆膜腔积液样体制作细胞蜡块结合免疫组织化学最终明确诊断恶性肿瘤50例，其中肺腺癌31例，消化道腺癌3例，乳腺癌2例，卵巢、输卵管及腹膜3例，肺鳞状细胞癌2例，其他恶性肿瘤9例。本组研究根据临床提供的患者病史，选择不同的免疫组织化学抗体组合，对50例可疑恶性胸腔积液样本进行标记，确诊增生反应性间皮细胞4例，确诊恶性肿瘤46例，其中肺腺癌27例，其他组织来源及组织类型19例。肺腺癌CK7、TTF1、NapsinA、CEA至少有两项以上阳性，且Calretinin、CK5/6、D2-40、Vimentin均阴性，TTF1及NapsinA在诊断肺腺癌有具有较好的敏感性和特异性[7-8]。罗巧明等[9]研究认为联合检测TTF-1、CA125、CK7、CK20能有效鉴别浆膜腔积液中来自肺、卵巢、胃肠道的腺癌。
肿瘤精准医疗己逐渐成为肺腺癌治疗的新方向[10]，近年来表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）为肺腺癌患者的治疗带来了新的靶向治疗手段，研究发现用吉非替尼治疗后的晚期肺腺癌患者的生存期明显延长，但用药前必须进行表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）的突变检测[11-13]。对穿刺活检获取组织病理学样本进行突变检测困难，但又迫切希望进行个体化治疗的晚期肺腺癌患者，胸腔积液细胞蜡块可作为一种较好的且可能是唯一的检测样本来源[14]。沈湘萍等[15]分析45例疑似恶性胸腔积液样本进行制作细胞蜡块切片发现胸腔积液沉渣包埋切片及免疫组织化学可作为恶性胸腔积液诊断的重要手段，并可为临床寻找和判断恶性肿瘤细胞组织来源及组织类型提供帮助。张丽华等[16]分析64例恶性细胞学样本发现利用细胞学剩余样本制备细胞蜡块，结合免疫组织化学标记物和基因检测技术有助于晚期恶性肿瘤的诊断，并为个体化治疗方案的选择提供可靠依据。本组研究中27例肺腺癌送检表皮生长因子受体（EGFR）检测18例，其中有表皮生长因子受体（EGFR）基因突变5例，突变率27.8%，与以往文献报道相近[17-18]。
总之，细胞蜡块免疫组织化学技术极大地提高了胸水细胞学的诊断准确率；同时为肿瘤精准医疗提供了平台，值得推广[19]。恶性胸水细胞块行免疫组织化学检测不仅有助于肿瘤的明确诊断，更有助于对肿瘤进行分类并判断肿瘤原发部位及帮助判断预后，利用胸水细胞蜡块可以对肺腺癌进行表皮生长因子受体（EGFR）基因突变的检测，为肺腺癌的基因检测提供新型的样本来源[20]。
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（收稿日期：2017-10-18）