‘新高’梨小孢子的发生及其形态变化的研究

摘要： 【目的】为了观察‘新高’梨花粉母细胞减数分裂及花粉发育过程，探讨‘新高’梨花粉败育的细胞学基础，【方法】以雄性不育的‘新高’和可育的‘丰水’梨为试材，采用常规压片法观察花粉母细胞减数分裂和花粉发育过程。【结果】结果表明，‘新高’梨花粉母细胞减数分裂过程中，染色体能正常配对形成二价体，经过2次分裂后产生四分体，随后释放出小孢子。然而在小孢子发育早期，小孢子发育缓慢；在中期，细胞质收缩，细胞壁加厚不明显，出现小孢子粘连；到小孢子发育晚期，大量小孢子出现粘连降解，或小孢子细胞壁破损，细胞质、细胞核降解消失。【结论】‘新高’梨花粉母细胞的减数分裂正常，其花粉败育发生在小孢子中出现液泡到单核晚期。

关键词：‘新高’梨； 花粉败育； 减数分裂； 细胞学

中图分类号：S661.2 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2012？雪06-1027-04

杂种优势的利用在提高农作物产量及抗病、抗逆性等方面发挥了重要作用。雄性不育系的应用大大地简化了杂交育种程序，同时也是生产一代杂种最经济、有效的途径。由于雄性不育系在蔬菜、农作物的杂交育种和制种等方面的实用性更强，以及拟南芥等模式植物研究的方便性，所以众多学者不仅在上述植物中努力寻找、挖掘和创造新的雄性不育资源，而且对其不育性从遗传学、细胞学、解剖学、生理生化和分子生物学等方面进行了研究[1-2]。在他们的研究中发现雄性不育系花粉败育时期和方式多样，从造孢细胞到二核花粉的各个时期都可发生，同一品系败育特征既可出现在一个时期，也可出现在相邻两个时期或多个时期。梨作为木本植物，其雄性不育资源没有像蔬菜等农作物在育种和制种方面的实用性，但梨的大多品种自花不结实，雄性不育不能为其他品种提供有效的授粉，这将极大地限制这种品种在生产中的选择与推广，因此梨雄性不育机理的研究也受到重视[3-4]。但纵观前人的研究，主要集中于雄性不育系本身的性状、花药组织结构及生理差异的比较[5-7]，而关于梨花粉败育时期及方式的系统研究国内外还未见报道。我们以‘新高’梨为试验材料，研究花粉母细胞减数分裂、小孢子发生及其败育过程中的细胞形态特征，为进一步研究其败育机理提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

试验以南京溧水新世纪园艺研究所梨品种园内长势一致、花量基本相同的6 a生‘新高’和‘丰水’梨为试材。从3月初开始，结合花药涂片和45%的醋酸洋红染色镜检，确定花粉发育的时期，分别在花粉母细胞、四分体、单核花粉期、单核花粉晚期、二核花粉期等发育时期收集花药，除一部分直接用作游离小孢子的压片观察外，固定于卡诺氏固定液（3倍乙醇∶1倍冰醋酸）中，最长不超过24 h，然后转移到70%酒精中，放在4 ℃冰箱保存备用。

1.2 方法

制片用常规压片法观察花粉母细胞减数分裂和雄配子体的发育，染色液分别为石炭酸品红和醋酸洋红[8]。Olympus-BX50型显微镜下观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 ‘新高’梨花粉母细胞减数分裂行为的观察

‘新高’梨花粉母细胞发育进入减数分裂前期I之前，细胞体积和细胞核显著地增大，由于DNA已复制，核的染色逐步加深（图版Ⅰ-A）。当进入细线期时，细胞核明显可见（图版Ⅰ-B）。在偶线期，经过同源染色体的配对，缠绕成一团的染色质线逐渐松散（图版Ⅰ-C）。当丝状的染色体逐渐缩短变粗时，非姊妹染色单体间发生了交换，此时已进入粗线期（图版Ⅰ-D）。终变期时，配对的染色体缩短到最小程度，可以看出17个二价体（图版Ⅰ-E）。进入中期I后，花粉母细胞里所有二价体均整齐而集中地排列在赤道板上（图版Ⅰ-F），发现极少的花粉母细胞里有个别染色体散落在赤道板之外（图版Ⅰ-G），细胞质里出现纺锤体。此后，同源染色体分离，染色体减半，花粉母细胞染色体均衡地分成两组并分别向两极移动。未发现花粉母细胞染色体出现分离落后的现象，以及染色体分离不同步的特点。进入减数分裂第一次分裂的后期（图版Ⅰ-H）。染色体移至两极后开始消失，松开变细，核膜重新出现，进入末期Ⅰ（图版Ⅰ-I）。与此同时，形成细胞板，将细胞分隔为二，形成二分体（图版-J）。第一次减数分裂后，细胞质并不分裂，而很快进入第二次分裂。中期Ⅱ：染色体各自排列在赤道板上，细胞之间有分裂不同步的现象（图版Ⅰ-K）。后期Ⅱ、末期Ⅱ：染色单体间顺利分离并移向两极（图版Ⅰ-L，M），细胞质分裂形成四分体（图版Ⅰ-N，O），随后释放小孢子（图版-P）。从减数分裂全过程来看， 除发现极个别的花粉母细胞在减数分裂中期I染色体落后外，未发现‘新高’花粉母细胞减数分裂的其他异常现象。‘新高’梨花粉母细胞的同源染色体能正常联会配对，并能正常分离，未发现小核的形成，细胞质也能正常分离形成四分体，这表明不育系小孢子发育在减数分裂期是正常的。

2.2 小孢子发育的形态观察

在对照品种可育的‘丰水’梨花药中，随着包围四分体的胼胝质壁的解体，四分孢子彼此分开，释放出大小相近的小孢子，即进入小孢子早期。在游离状态下，早期小孢子呈现圆球形或椭圆球形，细胞质浓、均匀，细胞核较大、位于细胞的中央，小孢子“壁”隐约可见（图版Ⅱ-A1，B1）。在小孢子中期小孢子增大，壁显著加厚，尚未形成中央大液泡。细胞质相对稀少，并贴向细胞的周边（图版Ⅱ-C1）。小孢子晚期中央大液泡形成，小孢子核靠近细胞的一边，细胞核呈圆形，并且体积增大，孢壁增厚（图版Ⅱ-D1），大体上恢复了圆球形，具有三个孔沟。由于这一时期核的位置及中央大液泡的特点，在一些文献中，常称之为“单核靠边期”。在二核花粉期：单核靠边小孢子里进行有丝分裂，形成大小不等的生殖细胞与营养细胞，生殖细胞逐渐变成梭形（图版Ⅱ-E1）。

而在不育的‘新高’梨，四分体刚释放小孢子中，约10%左右小孢子里出现2个核仁，而且核仁大小存在一定的差异（图版Ⅱ-F1），而后发育迟缓。到了单核小孢子中期，小孢子出现细胞质收缩等异常现象，小孢子壁增厚不明显，整个小孢子小于可育品种相应时期的小孢子，有些小孢子已开始相互粘连（图版Ⅱ-G1，H1）。随着小孢子的进一步发育，小孢子壁的发育仍然很差，也未出现三个孔沟（图版Ⅱ-I1，J1）。虽然有些小孢子的细胞核较完整，并且也移动到靠近壁的一侧，但小孢子形状不规则且大小不等，且出现细胞质收缩、细胞质解体的迹象（图版Ⅱ-K1）；大量的小孢子开始出现相互融合降解（图版Ⅱ-L1）。以后小孢子开始变形，表现为壁凸起，出现许多孔洞，进一步破裂降解（图版Ⅱ-M1）。与此同时，单核小孢子细胞质稀薄、收缩、解体，由于壁的破裂，细胞质开始外流，加剧了这一过程的的发生（图版-N1，O1）。核也紧随着变形、退化、解体，最后小孢子仅剩少部分降解残留物（图版-P1）。

3 讨 论

众多研究表明，由于不同的不育系控制花粉败育的基因不同，雄性不育系小孢子的败育时期会因为基因的表达时期以及基因作用机制不同而不同。因此，不同植物种类的雄性不育系的雄性败育的方式和时期也不相同，甚至同一不育系败育既可出现在某一时期，也可出现在两个时期甚至多个时期[9]。现已发现不同植物雄性不育系花粉的败育方式和时期是多种多样的，败育时期从造孢细胞期到二核或三核花粉的各个时期都可发生。有的发生在花粉母细胞的减数分裂期，如拟南芥的两个突变体msW和 msY在花粉发育早期发生异常，减数分裂不能正常进行[10]。本试验中‘新高’梨花粉母细胞，除少数在减数分裂Ⅰ中期有个别染色体提前解离或散落在赤道板上之外，绝大多数都能正常进行减数分裂，并形成四分体，释放出小孢子。由此可以肯定‘新高’花粉母细胞减数分裂期是正常的，花粉败育不在减数分裂期。目前，关于减数分裂异常行为与不育性发生的关系，仍是一个有争议的问题。有的研究者认为，一般情况下，如果雄蕊减数分裂异常，雌蕊虽能正常进行减数分裂，雌蕊也同样败育，所以在雌蕊可育的情况下，减数分裂异常行为偶有发生，不是不育性发生的主要原因。‘新高’的雌蕊是可育的，进一步验证了试验中所得到的结论。

随着‘新高’小孢子的发育，出现了一系列不同于可育品种小孢子发育的异常特征，表现为小孢子壁发育迟缓且壁薄，单核小孢子的核退化、解体，细胞质稀薄、收缩、解体，最后细胞壁也破损解体，很少看到有二核小孢子。说明花粉败育主要发生在单核小孢子出现液泡到单核晚期。Albbertson等[11]报道玉米GMS突变体ms2和ms7的减数分裂正常，在四分体时期就出现异常，小孢子细胞壁比正常的小孢子要薄。此后粟翼玟等[12]对秋冬萝卜雄性不育系64A及其保持系64B小孢子形态发生中不同发育时期的花药和小孢子的观察表明，不育系中从四分体初释放的单核小孢子与正常者无可见差异，当单核小孢子内开始出现小液泡时即呈现败育，胞质淡染，外粉壁薄，整个小孢子停止膨大；随后其细胞核染色浅或仅见微小核仁。‘新高’梨与上述不育系中小孢子败育的时期和方式极为相似，说明‘新高’梨和上述材料可能存在相似甚至相同的败育机制。由于上述不育材料有的作为突变体，有的有相应的保持系，利用现代分子生物学技术和手段，比较容易克隆出控制不育的相关基因，这可能为我们从分子水平揭示‘新高’梨的败育机制提供了便利和捷径。

一般认为，花粉壁物质的来源，在四分体时期，只由小孢子的细胞质提供，当小孢子分离以后，壁物质除来自小孢子本身外，还来自绒毡层。说明‘新高’梨小孢子壁发育不良可能与小孢子和绒毡层都有关。‘新高’梨单核小孢子胞质解体，在许多雄性不育系中也都观察到了这一现象。如韩笑冰等[13]观察到小麦小孢子败育时也表现为胞质稀薄解体，认为细胞质中细胞器的结构和功能的改变对小孢子败育起着重要作用。胡适宜等[14]也曾对不育系单核小孢子的亚微结构观察，看到小孢子胞质稀薄以及液泡系活动异常。有分析认为小孢子内含物的迅速降解很可能与溶酶体的作用有关。至于本试验中出现的单核小孢子胞质解体是否与液泡等细胞器有关，还需要开展进一步的研究。

综合上述，‘新高’梨花粉母细胞能够正常进行减数分裂，并产生小孢子，小孢子解体发生在小孢子中出现液泡到单核晚期。（本文图版见插4，封3）

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