TopoⅡ、Ki—67、P53在胃食管结合部腺癌新辅助化疗疗效预测中的意义
[摘要] 目的 探讨Topo Ⅱ、Ki-67和P53 在Siewert Ⅱ型胃食管结合部腺癌中的表达与化疗敏感性之间的关系。方法 回顾性分析本院2010年6月～2013年12月行新辅助化疗的胃食管结合部腺癌患者72例。对所有患者均行SOX方案化疗，以RECIST 1.0评价标准评价疗效。用免疫组化方法评价3种蛋白的表达情况，分析各蛋白表达情况及与化疗疗效的关系。 结果 年龄和病理类型与化疗敏感性无关，本组72例患者中新辅助化疗有效率为48.6%，其中5例达病理完全缓解。3种蛋白的表达情况分别为：Topo Ⅱ阳性率为73.6%， Ki-67阳性率为59.7%， P53阳性率为33.3%。 Ki-67和P53的表达与化疗敏感性有关（P=0.023，P=0.031），但Topo Ⅱ的表达与化疗敏感性无关（P>0.05）。 结论 Ki-67高表达和P53低表达是AGEJ SOX方案新辅助化疗敏感性的影响因素，为AGEJ个体化新辅助化疗方案的选择提供有益的参考。
[关键词] 胃食管结合部肿瘤；新辅助化疗；Topo Ⅱ； Ki-67；P53；化疗敏感性
[中图分类号] R737.9 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2015）04-0113-04
[Abstract] Objective To investigate the expression of Topo Ⅱ， Ki-67， P53 in advanced adenocarcinoma of gastroesophageal junction（AGEJ） and its relationship to sensitivity of neoadjuvant chemotherapy. Methods Clinical data of 72 patients of locally advanced AGEJ between June 2010 and Dec 2013 were analyzed retrospectively. All patients were given SOX neoadjuvant chemotherapy and the responses to treatment were evaluated according to RECIST 1.0. Expressions of 3 proteins were detected by in all patients before neoadjuvant chemotherapy. Detecting the expressions of Topo Ⅱ， Ki-67， P53 by immunohistochemistry is to analyze its relationship to neoadjuvant chemotherapy. Results The chemotherapy sensitivity had no correlation with age and pathological types（P>0.05）. The overall response rates was 48.6%， including complete response in 5 cases and progressive disease in 6 cases.The positive expression rates of Topo Ⅱ， Ki-67 and P53 in AGEJ were 73.6%，59.7% and 33.3%. Ki-67 and P53 were significantly correlated with chemotherapy sensitivity（P=0.003，P=0.020）， while Topo Ⅱ was not correlated with chemotherapy sensitivity（P>0.05）. Conclusion An elevated expression of Ki-67 and depressed expression of P53 are important factors for SOX insensitivity in AGEJ. They may provide an useful reference for designing individualized chemotherapeutic regimens for AGEJ patients.
[Key words] Gastroesophageal junction neoplasms； Neoadjuvant chemotherapy；Topo Ⅱ； Ki-67；P53；Chemosensitivity
近年来胃食管结合部腺癌（adenocarcinoma of gastroesophageal junction，AGEJ）的发病呈增长趋势[1，2]。现已证实新辅助化疗对进展期胃癌能提高手术切除率、减少术后复发转移、延长生存期[3]。但对于Siewert Ⅱ型胃食管结合部腺癌新辅助化疗的疗效针对性研究较少。寻找可靠的化疗敏感性预测指标、早期筛选出对化疗应答不敏感的患者、减少不必要的术前化疗，已成为重要临床课题之一。结合既往胃癌方面的研究成果，我们回顾性检测3种蛋白质：Topo Ⅱ、Ki-67和P53在AGEJ癌活检标本中的表达，研究化疗药物敏感性的差异，寻找可靠的化疗敏感性预测指标、期望筛选出可能对SOX方案新辅助化疗敏感的预测因子，为AGEJ癌的个体化治疗提供重要的依据。
1资料与方法
1.1一般资料
收集2010年6月～2013年12月在河南省安阳市肿瘤医院行新辅助化疗的72例进展期Siewert Ⅱ型AGEJ癌患者。其中男63例，女9例；年龄40～76岁（中位年龄67岁）；治疗前临床分期均为cT3～4Nl～3。术前病理类型：中、低分化腺癌66例（其中4例伴印戒细胞癌，7例伴黏液腺癌），高分化腺癌2例，黏液腺癌3例，印戒细胞癌1例。研究对象的选择标准：①胃镜活检病理确诊为腺癌；②排除远处转移；③腹部增强CT显示局部肿块侵犯胃壁全层（T3或T4）或有区域淋巴结肿大；④所有患者体力状况（ECOG）评分为0～2分，且无严重心、肺、肝、肾等脏器功能异常者；⑤无其他恶性肿瘤病史及放化疗史者；⑥签署知情同意书，愿意接受术前化疗及手术者。
1.2治疗方案
所有患者行SOX方案新辅助化疗：奥沙利铂注射液130 mg/m2静脉滴注2～3 h d1+替吉奥胶囊40～60 mg bid po d1～14。3周后重复，共2次。化疗同时予以地塞米松、西米替丁、格拉司琼、苯海拉明等辅助用药治疗。化疗结束后4周进行术前疗效评价，若无肿瘤进展则行标准胃食管结合部腺癌根治术（D2）。术后给予常规辅助化疗。
1.3 检测方法
1.3.1 临床检测 新辅助化疗前对活检肿瘤组织作3种蛋白检测，在新辅助化疗前后分别进行胃镜（或超声胃镜）、64排增强CT检查以对比疗效评价，手术者术后行病理组织学检查、疗效评价。
1.3.2 免疫组化检测 标本的处理及免疫组织化学染色：所有标本用10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片厚4 μm。玻片用多聚-L-赖氨酸涂覆，常规苏木素-伊红（HE）染色，确定病理类型。采用柠檬酸缓冲液微波抗原修复法。实验试剂：鼠抗人Topo Ⅱ（Ki-S1）、鼠抗人Ki-67（MAB-0129）、鼠抗人P53（DO-7）、即用型单克隆抗体、检测试剂盒（KIT-9701）、阳性对照片均购自福州迈新生物技术开发公司，操作按说明书进行。
S-P免疫组织化学染色方法简述如下：石蜡切片经常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化；柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复；滴加过氧化酶阻断液室温10 min，磷酸盐缓冲液（PBS） pH=7.2冲洗后滴非免疫性动物血清室温10 min，滴加第1抗体即抗Topo Ⅱ、抗Ki-67、抗p53，4℃冰箱孵育过夜；PBS冲洗后滴加生物素标记的第2抗体室温10 min；PBS冲洗后滴加链霉素亲和素-过氧化物酶溶液室温10 min，PBS冲洗后二氨基联苯胺（DAB）显色，冲冼，苏木素复染，封片，显微镜观察。每次实验用已知阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。Topo Ⅱ、Ki-67、P53蛋白均定位于细胞核，以细胞结构中存在粗细一致的棕黄色颗粒为阳性。阳性细胞数<50%表示基因低表达，计为（-），而≥50%则表示基因高表达，计为（+）。以上结果由2名病理学专家阅片判断。
1.4 疗效判断
以新辅助化疗前后胃镜（或超声胃镜）、64排增强CT及术后病理切片作为疗效判断的证据。新辅助化疗后原发病灶的疗效判定根据RECIST 1.0[4]标准评估，分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、疾病稳定（SD）、疾病进展（PD）。以CR+PR计算有效率（RR）。毒性反应采用NCI-CTC 3.0不良反应分级标准判定[5]。
1.5 统计学分析
使用SASW18.0统计软件，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，相关分析采用Logistic多因素回归分析及Spearman秩相关处理相关数据。检验水准α=0.05。
2结果
2.1 病理特征
分化良好型[6]（包括管状腺癌、乳头状腺癌、高中分化腺癌）38例，分化不良型（低分化腺癌、黏液腺癌、印戒细胞癌、未分化癌和单纯癌）34例。PD患者共6例未行手术治疗，余66例均行R0切除，年龄<65岁者45例，≥65岁者27例。患者年龄、肿瘤分化程度与化疗效果关系见表1。
2.2 治疗情况
本组72例患者全部完成新辅助化疗SOX三周方案两个周期。不良反应主要为恶心、呕吐、粒细胞减少、血小板减少、外周神经毒性，经对症治疗后缓解，未出现Ⅲ度及以上毒副反应。新辅助化疗后4周行标准胃食管结合部腺癌根治术（D2），术中进行肿瘤测量。术后并发症：3例患者出现吻合口出血，2例患者出现吻合口瘘，均保守治疗后治愈。
2.3 新辅助化疗结果及术后病理结果
本组66例手术患者新辅助化疗综合疗效判断：5例CR（6.9%），30例PR（41.7%），31例SD（43.1%）。新辅助化疗总有效率RR（CR+PR）为48.6%，显示对SOX三周方案化疗敏感。术后病理结果：5例未见残留癌细胞，均为低-中分化腺癌或低分化腺癌，而且不合并黏液腺癌或印戒细胞癌等其他成分。4例仅见灶状散在癌细胞簇，分别为中低分化腺癌、中分化腺癌合并乳头状腺癌、低分化腺癌、中分化腺癌。显示单纯中低分化腺癌化疗效果较好。术后病理分期（2010年美国癌症联合会（American Joint Committee on Cancer， AJCC）第7版TNM分期标准）[7]：术后病理9例无法分期（5例未发现残留癌细胞，4例癌细胞零散分布，无法判定T分期），Ⅱ期23例、Ⅲ期34例。
2.4 各个蛋白检测的结果
各蛋白的表达与年龄、分化程度无明显相关性（P>0.05）。在72例AGEJ癌标本中，3种蛋白的表达情况及与化疗疗效的关系见表2。Topo Ⅱ阳性表达为53例（73.6%），在CR+PR组和SD+PD组之间无显著性差异（P>0.05）；Ki-67阳性表达43例（59.7%），在CR+PR组中阳性率明显高于SD+PD组（χ2=8.593，P=0.003）；P53阳性表达24例（33.3%），在CR+PR组中阳性率明显低于SD+PD组（χ2=5.449，P=0.020）。多元回归结果显示Ki-67是影响胃食管结合部腺癌新辅助化疗疗效的独立因子（P=0.015）。Spearman相关分析显示：Topo Ⅱ的表达与Ki-67的表达呈正相关（r=0.405，P=0.001），而TopoⅡ与P53、Ki-67与P53的表达之间均无明显相关性（P>0.05）。
3讨论
研究表明[8]AGEJ与中远段胃癌在临床病理指标及分子标记物上存在显著差异，提示AGEJ与中远段胃癌的发生发展过程中可能存在不同的分子机制。新辅助化疗在胃癌中受到越来越多的重视，Li等[9]报道新辅助化疗能显著改善中国人局部进展期胃癌的治疗效果。但将AGEJ单独进行新辅助化疗研究的报道仍较少。肿瘤细胞耐药是降低消化道肿瘤患者生存率的主要原因。如何预测AGEJ化疗敏感性的问题有待解决。如果能找到较为准确的预测新辅助化疗敏感性标志物.将有助于临床医生根据肿瘤的分子生物学特征选择更有效的治疗方案，减少原发性耐药的比例，避免不获益的治疗。
本研究中应用SOX方案对AGEJ进行新辅助化疗，有效率为48.6%，与胃癌的报道基本相似[10]，达到了降期、提高R0切除率的目的。本组72例患者新辅助化疗不良反应主要为恶心、呕吐、粒细胞减少、血小板减少、外周神经毒性，经相应治疗后缓解，不良反应均在可控制范围内；术后并发症仅有3例吻合口出血、2例吻合口瘘，提示新辅助化疗是安全的，并未增加手术并发症及手术风险。化疗效果与年龄、分化程度无明显相关性。
本文回顾性研究了Topo Ⅱ、Ki-67和P53在胃食管结合部腺癌新辅助化疗前的表达，探讨其与化疗敏感性的关系。肿瘤细胞中Topo Ⅱ表达的增强可以提高以DNA拓扑异构酶为靶点的抗肿瘤药物的抗癌效果[11]。其含量下降及酶活性的改变引起易解离复合物形成减少，导致DNA损伤减少而致药物耐受。在本研究中Topo Ⅱ的表达与化疗效果之间无明显相关，与在部分胃癌辅助化疗中研究[12，13]相一致，其表达尚不能预测SOX方案在胃食管结合部腺癌新辅助化疗的作用。Ki-67是一种细胞核抗原，仅在增殖细胞核中表达，与细胞的合成代谢有关， 其表达水平能较全面客观地反映肿瘤细胞的增殖状态，是较为理想的检测细胞增殖活性的抗体。研究已证实[14，15]，Ki-67是判断肿瘤患者化疗疗效的重要指标。本研究的结果显示：Ki-67的表达与化疗敏感性有关，Ki-67高表达患者对化疗敏感，疗效优于低表达患者，并且多因素回归分析显示，Ki-67是独立的化疗敏感性影响因素。突变型P53基因是促癌基因，当该基因发生突变时，对细胞凋亡的调控作用受阻，导致肿瘤细胞对化疗药物产生耐受性。本组结果显示，P53表达阳性者新辅助化疗有效率明显低于表达阴性者，与胃癌[13，16]的研究结果相似。Ki-67的表达与Topo Ⅱ的表达呈正相关（r=0.405，P=0.001），而Ki-67与P53表达无明显相关性（r=-0.090，P=0.49）。
总之，本研究应用免疫组化检测了3种蛋白在AGEJ中的表达，发现Ki-67和P53与化疗敏感性有关，可作为评估化疗预后的因子。
[参考文献]
[1] Wijnhoven BP，Louwman MW，Tilanus HW，et al. Increased incidence of adenocarcinomas at the gastro-esophageal junction in Dutch males since the 1990s[J]. Eur J Gastroenterol Hepatol，2002，14（2）：115-122.
[2] Sihvo EI，Salminen JT，Ramo OJ，et al. The epidemiology of esophageal adenocarcinoma： Has the cancer of gastric cardia an influence on the rising incidence of esophageal adenocarcinoma[J]. Scand J Gastroenterol，2000，35（10）：1082-1086.
[3] 季加孚，季鑫. 胃癌新辅助化疗的现状与展望[J]. 中国肿瘤临床，2012，39（20）：1458-1461.
[4] Therasse P，Arbuck SG，Eisenhauer EA，et al. New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors[J].J Natl Cancer Inst，2000，92（3）：205-216.
[5] Trotti A，Colevas AD，Setser A，et al. CTCAE v3.0： Development of a comprehensive grading system for the adverse effects of cancer treatment[J]. Semin Radiat Oncol，2003， 13（3）：176-181.
[6] 赵晓龙，朱兆华，黄开红，等. 胃癌患者临床预后及病理因素与瘦素表达的相关性研究[J]. 中华实验外科杂志，2004，21（5）：524-526.
[7] Rice TW，Rusch VW，Ishwaran H，et al. Cancer of the esophagus and esophagogastric junction：Data-driven staging for the seventh edition of the American Joint Committee on Cancer/International Union Against Cancer Cancer Staging Manuals[J]. Cancer，2010，116（16）：3763-3773.
[8] 叶延伟，师英强，王春萌，等. 贲门癌与胃窦部癌的临床病理指标及免疫组化指标差异性分析[J]. 中华医学杂志，2009，89（14）：962-966.
[9] Li ZY，Koh CE，Bu ZD，et al. Neoadjuvant chemotherapy with FOLFOX： improved outcomes in Chinese patients with locally advanced gastric cancer[J]. J Surg Oncol，2012， 105（8）：793-799.
[10] 李涛，陈凛. SOX方案新辅助化疗应用于进展期胃癌的有效性和安全性研究[J]. 中华胃肠外科杂志，2011，14（2）：104-106.
[11] Kim JS，Amorino GP，Pyo H，et al. Radiation enhancement by the combined use of topoisomerase Ⅰ inhibitors，RFS-2000 or CPT-11，and topoisomerase Ⅱ inhibitor etoposide in human lung cancer cells[J]. Radiother Oncol，2002，62（1）：61-67.
[12] 宋延强，李扬，林惠忠，等. 胃癌新辅助化疗前后多药耐药基因的表达及其与化疗敏感性的关系[J]. 中华普通外科杂志，2009，24（5）：365-367.
[13] 曲建军，石毅然，郝风云，等. 进展期胃癌新辅助化疗疗效预测因子的临床研究[J]. 中华胃肠外科杂志，2013， 16（3）：276-280.
[14] Xu JM，Azzariti A，Tommasi S，et al. Combination of 5-fluorouracil and irinotecan on modulation of thymidylate synthase and topoisomerase I expression and cell cycle regulation in human colon cancer LoVo cells： clinical relevance[J]. Clin Colorectal Cancer，2002，2（3）：182-188.
[15] 刘扬，庞达. 乳腺癌新辅助化疗前后Ki-67、HER-2、ER和PR的变化与临床缓解率的关系[J]. 实用肿瘤学杂志，2011，25（5）： 442-445.
[16] Kamoshida S，Suzuki M，Shimomura R，et al. Immunostaining of thymidylate synthase and p53 for predicting chemoresistance to S-1/cisplatin in gastric cancer[J]. Br J Cancer，2007，96（2）：277-283.
（收稿日期：2014-12-08）