水产品中呋喃它酮代谢物AMOZ残留的测定

材料与仪器

1.主要仪器

MK3型酶标仪：赛默飞世尔（上海）仪器有限公司;数显电热培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂;刀式研磨仪：RETSCH公司;PL602-L电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司;3-18k型高速冷冻离心机：Sigma公司;多管漩涡混合仪：美国安胜科技有限公司;N-EVAP-24氮吹仪：美国Organomation公司。

2.试剂与溶液

呋喃它酮试剂盒：德国拜发集团;检测下限为0.2μg/kg，包括：96孔酶标板、AMOZ标准品（0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1ng/mL）、洗涤缓冲液（盐）、抗体、酶标记物、基质/发色剂、反应终止液等。呋喃类组织前处理试剂盒：德国拜发集团;包括：1号试剂、2号试剂、3号试剂、4号试剂。正己烷：天津市富宇精细化工有限公司，乙酸乙酯：广州化学试剂厂。

三、实验步骤

1.样品处理

鱼去皮，取背部肌肉，用刀式研磨仪制成均质物。

2.样品制备

（1）称取0.9g已均质的样品于15mL离心管中，依次加入3.6mL蒸馏水、0.45mL1号试剂、108μL2号试剂。

（2）振荡混匀后，在50℃培养3h或者37℃恒温培养16h。

（3）分别加入4.5mL3号试剂、0.36mL4号试剂、4.5mL乙酸乙酯，涡旋震荡30秒。

（4）在室温20-25℃下转速4000rpm离心10分钟。

（5）取2.5mL上清液到一干净离心管中，通过热氮气吹干（50-60℃水浴）。

（6）加入1mL的正己烷到吹干的样品管中溶解干燥物，加入1mL洗涤液，均匀混合。

（7）室温下转速4000rpm离心10分钟。

（8）弃除上层有机溶液（如中间有乳化层，也一并弃除），每孔取出适量的下清液备用。

3.测定

（1）将呋喃它酮试剂盒从冰箱中拿出，回温至室温。

（2）取出足够数量的微孔条插入微孔架，各个标准液（0，0.1，0.3，0.9，2.7，8.1ppb）和每份待测样品均做2个平行样，并记录标准品及样品的位置。

（3）加入50μL的标准品或处理好的样品到各自的微孔中。

（4）加入50μL酶标记物到微孔底部，用手将轻轻摇动微孔板混合。

（5）加入50μL抗体到微孔底部，轻敲微孔架四周，使其充分混合后于室温（20-25℃）下避光静置温育60min。

（6）倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打（至少拍打三次）以完全除去孔中的液体（如果有气泡，可用吸耳球吹破），用多通道移液器向孔中加满250μL洗涤缓冲液，再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体，再重复操作洗涤步骤两次以上。

（7）加入100μL基质/发色试剂到微孔中，轻敲微孔架四周，使其充分混合。

（8）于室温下避光静置温育15min。

（9）于每一微孔中加入100μL反应终止液，用手将轻轻摇动微孔板混合。

（10）用酶标仪于波长450nm下进行吸光度测定。

4.数据处理

以标准品百分吸光度为纵坐标，标准品浓度对数值为横坐标，绘制标准半对数曲线图。将样品的百分吸光度代入标准曲线中，从标准半对数曲线中读出样品所对应的浓度，乘以前处理时的稀释倍数即为样品中呋喃它酮代谢物的实际浓度。

四、结果

1.AMOZ标准曲线

根据AMOZ标准品的ELISA检测结果绘制标准半对数曲线，见图 1。

AMOZ标准半对数曲线从图 1可知，标准曲线方程为Y=﹣22.34X+67.42，相关系数R2=0.9965。式中：Y为B/B0×100;X为样品浓度的对数值。

2.回收率检测

向0.9g生鱼空白样品中分别加入0.45、0.9、1.8ng的AMOZ标准样品，每个浓度做3个平行，然后按照3.2和3.3的步骤进行前处理及检测。实验结果见表 1。

从表 1可以看出：呋喃它酮代谢物回收率在92.00%～113.00%，平均值為99.83%。

3.各鱼样的检测结果

共检测了18份水产品，各样品的测定结果见表 2。

从表 2的结果中可以看出，鲩鱼、鳊鱼2个样品都检出了AMOZ残留，测定结果分别为0.27、0.61μg/kg，其他样品都未检出。

五、结语

本试验采用ELISA法对水产品中呋喃它酮代谢物的残留状况进行了检测，结果表明绝大多数的样品符合规定，只有极少数部分有检出。

ELISA是酶标抗体与抗原进行的抗原-抗体反应。由于酶的专一性催化作用，酶标板上可同时检测多份样品，故操作简易，灵敏度高，重现性好。本实验的平均回收率在94.67%～106.67%之间，且在0.1～8.1ng/mL测量范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.9965。呋喃它酮代谢物含量与百分吸光度的线性方程为Y=﹣22.34X+67.42，因此ELISA非常适于大批量检测水产品中AMOZ残留含量。本方法作为一种快速筛选手段，配合精密仪器确证使用，在日常水产品大批量监测中有着十分广阔的应用前景。

参考文献：

[1]生威，吴雪宁，李诗洁，等.呋喃它酮代谢物可视化凝胶柱快速免疫检测方法研究[J].现代食品科技，2017，33（05）：277-281+318.

[2]束建花，郭红艳，王立琦，等.呋喃它酮代谢物人工抗原的合成及抗体的制备[J].华南农业大学学报，2014，35（02）：18-23.

[3]颜露. 呋喃它酮代谢物AMOZ单克隆抗体的制备及免疫学检测方法的研究[D].暨南大学，2011.

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