组织RT-PCR注意事项（）

　1. 抽提 RNA 都是为了得到其 mRNA ，而 mRNA 和组织的状态密切相关，因此需要超低温的状态，一般选择用液氮保存组织。而且去的时候要尽可能的新鲜， 动作要快，取后立即放入液氮罐 中。

　2. 提取 RNA 前要对脑组织进行研磨，切记要在液氮中进行，也是为了防止 rna

　的降解。研磨要充分，使组织块变小。

　3. 加入 trizol

　后要充分吹打开，目的是使组织中的核蛋白体，多糖等与 rna 分离。

　4. 其次是注意外源性的 rna 酶污染，操作全过程要戴口罩，手套。操作速度要快，冰上进行。

　我做过大鼠下丘脑组织的 RT-PCR，在动物房将组织取好先放在 RNa －free 的 EP 管中，放在冰盒内，然后再转移到实验室的－ 70°冰箱内，在抽 RNA 的时候，脑组织最好要氯仿抽提两次， 这个是我在别的地方看到的，但是真的很好用，可以改善

　RNA 抽提的质量。

　用生理盐水或 PBS 冲洗掉血液，分切成50-100mg 大小的组织块，早点把提 RNA 的试剂盒买过来就可以根据说明书加入变性液中（

　ep 管内），－ 80

　储存，到时候拿出来组织就很容易撵碎了。如果试剂盒没到， 那就直接放在 EP 管中， 提 RNA 的时候再拿出来再加也可以。

　就是组织可能会不容易撵碎一些。

　我觉得你可以用高压过的 EDPC 处理的水进行清洗 （ 2－ 3 次），后迅速切成合适的大小的组织 （具体大小与 RNA 提取方法相关，我用的是 TRNZOL

　法，一般取 50 － 100mg ，）于 EP 管中， 直接放到－ 80 度冰箱，不需要液体浸泡！到时直接取出提取

　RNA

　即可！建议你的剪刀、镊子等物品最好 DEPC 处理过！

　1. 组织块若没有很多血液，可直接冻存； 2. 若有较多血液，可用生理盐水冲洗； 3. 我以前取小肠组织时，先剪开自来水冲洗，再生理盐水冲洗； 4. 一般 1cm 左右就可以，根据标本将来的用途。

　5. 直接原组织冻存。

　本实验室做过人子宫内膜 FGF 基因的克隆，方法是从子宫肌瘤切除的人子宫中撕下新鲜内膜组 织，冻存与液氮总备用，实验前在液氮中充分研磨后提取总

　RNA。因为我们的目的是 PCR 出目的基因， 因此并不要求材料 100 ％的纯净， 只要引物正确， 反应条件合适一般能克隆出目的基因。

　例如：从猪肝脏中提取总 RNA（本人实验经验）

　：

　采用 Trizol

　试剂从新鲜猪肝脏组织中提取总 RNA 。将液氮冻存的新鲜猪肝脏组织约 50mg 放入 EP 管中，用研磨杵迅速研磨，然后加入

　1mL Trizol 试剂室温裂解 5min 。然后 10000r/min ，离心 1min ，将上清液转移到另一新的 EP 管中 ,加入 200μL氯仿轻轻混匀，室温静置

　3min 。4℃， 12000r/min ，离心 10min ，转移上层水相至另一新的 EP 管中，加入 0.5mL

　 异丙醇混匀，室温静置 5min 。4℃， 12000r/min ，离心 10min ，可以看到白色的 RNA 沉淀贴于 EP 管底部，弃上清后用 75% 的乙醇洗涤，真空干燥后用

　 100μLDEPC 处理过的 ddH2O

　溶解 RNA 沉淀。含有 RNA 的溶解液立即反转录，剩余部分零下

　70 ℃冻存。

　另外我用过 RNA 提取试剂盒效果也很好，方便，快速，纯度较高组织匀浆 器械：

　DEPC 水处理的匀浆器，一次性换药包，一次性刀片， DEPC 水处理枪头，电动匀浆器

　1. 新鲜或冰冻组织用蒸馏水冲洗除去表面污物切下 1mm(3) 组织块 2. 将组织放入 1。

　5ml 的试管底，试管配有研棒 3. 加入 1mlTrizol 4. 插入研棒研磨碎组织块，旋转研棒将组织挤压在使馆壁上， 10 次左右（电动 1－ 2 次）

　5. 因标本已匀浆话，将匀浆管至于 4 度冰桶中提取组织 RNA 提取 RNA 提取组织 RNA 的准备事项 1。准备 DEPC 泡的枪头，以及 DEPC 泡的匀浆器 2。用 DEPC 配制的 1*PBS 清洗组织 3。准备 DEPC 水配制的 75% 的酒精，泡制手术器械。带者酒精在火上燎一下。

　4。

　器械：离心管

　2 支，吸管 4 个，酒精灯，打火机，记号笔，

　 200ul,1000UL

　 枪， DEPC 泡过的枪头 EP 管，紫外照过的手套。滤纸，

　DEPC 纯水（ 750ml

　无水乙醇＋ 150mlDEPC

　水,剧烈振荡，使劲的摇晃，直至混匀）

　，氯仿， 75 ％酒精，异丙醇， Trizol ，预冷的离心机（两种）

　，EP 管架（洗液擦洗）

　,手套，灭菌剪刀，镊子（ 2 个），冰桶，冰块，高灵敏度称量仪

　1. 将组织取出后用眼科剪剪成 1mm3 左右的小块 2. 组织样品按 50 － 100mg/mlTrizol 加入 Trizol( 组织体积不能超过 Trizol 体积的 10 ％，否则匀浆效果不好， （此时可预冷另一个离心机）

　，研磨 10 次左右（剩余的组织至于冰桶中，最后存于液 氮中 3. 4

　度， 12000g 离心去除不溶物 ( 匀浆得时候最好将匀浆器放置在冰水中以免发热 ) 4. 带双层手套，混合好的样品全部移置到 0.1ml

　的 EP 管中，室温 15 － 30 度静置 5 分钟 5. 加入 0.2ml

　氯仿 /1mlTrizol,

　盖好 EP 管，剧烈振荡（上下颠倒）

　， 15 秒钟，室温静置 2－ 3min 6. 2 － 8 度，离心， 10500rpm/min ，15min, 取上清，用 200ul 在 20ul 刻度使用，小心不要使界面混淆，剩余界面上不要）

　7. 上清中加入等量的异丙醇 (一般是 0.5:1),

　颠倒 5 次（用 200ul

　枪加小心）

　，室温静置 10min 7. 2-8

　度离心， 10500rmp/min,10min, 弃上清 8. RNA 洗涤：

　75 ％酒精（这次用的 100 ％。未影响）

　1ml 沉淀，轻轻弹其底部（直接放入－ 70 度冰箱可以长期保存，静置几秒钟 9. 2－ 8 度离心， 8500rpm/min,5min , 弃上清 10. ． 取出滤纸，将 EP 管敞开放在滤纸上，管口向酒精灯（不要完全干燥，不好溶解）

　11. DEPC 水溶解（ 30ul, 可变），分装 ,2ul

　电泳， 2ul

　比色，其余 5ul 分装至于手套中冻于－ 20 度中 大概量为组织（ ugRNA/mg 组织）：

　1 － 10ug 28s 是 18s 亮度的两倍（晾干时间过长会使 RNA 降解）

　根据我抽提的经验， 当提取组织 RNA 时一般都有白色沉淀， 当细胞量多的时候也可以看到少许，

　不应该是蛋白质。

　用酒精洗涤两次比洗一次好，

　然后等到差不多完全透明以后再加 DEPC 水溶解， 可以放四度冰箱过夜，然后比色。最好比色 1.8 ～ 2.0 ，一般 1.70

　以上都可以逆转录，没问题的。据我提取 RNA 的经验，一般在加入异丙醇并离心后都会在管底部看到一抹带状的白色沉淀，量 不会很大，如果很大的话，预后并不乐观，蛋白污染而且严重降解。如果提取材料量少的话，也 有看不到任何东西的情况，我就会弃之增大样本量，因为肉眼看不到的话，即使有也有限。

　而且我一般会在提取总 RNA 以后，跑胶看看提取的质量，有无降解，有无 DNA 污染，然后定量后才

　做 RT 的。所以我认为你应该适当增加提取的细胞数。

　1. TRIZOL

　：无论保存还是使用的时候都不要摇动， 因为我们使用 TRIZOL 提取 RNA 实际利用的是异硫氰酸胍 / 苯酚法，苯酚很容易被氧化，所以不要摇动，使用时也要从最底层吸取，也就是 避免破坏表面的保护层。

　2. 标本保存：提取组织

　 RNA 时涉及保存标本的问题，现在有一种样品储存液，其中含有

　RNase 抑制剂， 可以帮助保护 RNA ，当然仍需低温 . 另外还可以将标本浸在

　TRIZOL 里，－ 70 ℃或－ 20 ℃ 即可。

　3. 减少 DNA 污染：可以适当多加一些 TRIZOL 4. 晾干：

　75 ％酒精洗涤 RNA 沉淀后，需要晾干。建议 75 ％酒精洗后再用无水乙醇冲洗一边，这样液体挥发的比较快 2. 4. 晾干：

　75 ％酒精洗涤 RNA 沉淀后，需要晾干。建议 75 ％酒精洗后再用无水乙醇冲洗一边， 这样液体挥发的比较快

　我认为第四步有点问题，原理和操作都有问题！

　通常我这么来晾干， 1、尽量吸干 75 ％的乙醇； 2、5000rpm 短暂离心； 3、再次用黄色 tip 头吸干，尽量吸干液体 4、自然风干 5‘ m， in 绝对可以做以后的实验了！

　3. 其实 Trizol 的工作容量是有一定限度的， 当蛋白质特别丰富的时候，有的时候蛋白质不能全部沉在中间层， 可以把上清提出来，用 Trizol 重新提取， （充分振荡，加氯仿）

　把蛋白质逐步去处。

　也可用酚氯仿反复抽提。

　需要特别指出的是，本人更推荐单独用酚充分振荡，然后再加氯仿， 不提倡酚氯仿提前混在一起。

　我刚做过肝肺的。结果很不错。

　（斑竹给我加分鼓励我啊）

　一、组织抽提：

　1. 取组织块 60 ㎎左右，加入 400 － 600ul 的 TRIZOL 用匀浆器撵成浆液状。

　2. 然后移到 1.5ml 的 EP 管中，加入剩余的 Trizol ，最终 Trizol 的量为 1ml 。

　3. 冰上孵育 5 分钟 5. 离心 12,000g 4 ℃ 5 分钟 取上清液移入 1.5ml 新离心管。

　注意取组织块不要太多。太多反而效果不好。我们这么做出来的 OD 值都在 1.9 左右。后面的步骤就和做细胞的 RT-PCR 一样了。

　在反应体系中加入 BSA（ 10 － 100ug/ml ）可屏蔽有害物质对 PCR 的抑制作用， 提高扩增成功率。我们的方法如下：

　1、取材时，最好预先准备好去 RNA 酶的水或生理盐水，组织取下后，用 RNA 酶的水或生理盐水冲洗干净； 2、器材最好 200 度干烤 2 小时，塑料制品用 0.1 ％ DEPC 水浸泡过夜，烤干后高压； 3、我们一般放在液氮里，如果不方便的话，可以从液氮里转到 -80 度冰箱。

　1 各种器械一定要高温（ 180 度 4 小 时或 200 ， 2 小时）烤，取材用的玻璃器皿，锡箔纸，最好都烤过。

　2 塑料制品泡 DEPC，高压后（去除残留的 DEPC），烤干。

　3，操作时动作迅速，戴帽子口罩手套该是常识吧。

　4 尽量用新鲜组织。非要保存当然要液氮，保存时间不宜过长。

　我们实验室用的只是普通高压过的器械，也没有什么问题。

　不放心的话， 可以用 DEPC 泡一下再高压，至于 TIP 头还是泡一下，安全起见，但我同学提的时候从不用

　 DEPC

　也照样能提出来啊， 他们说新的包装里面一般没有污染的，但装入盒时一定要带口罩阿

　如何去除 RNA 酶外源性来源 1. 被污染的缓冲液 2. 自动移液装置应采取的措施 1. 当处理 RNA 酶时保证自动移液器专用 2. 将要用到的用于 RNA 试验的玻璃器皿、塑料制品和缓冲液留出来专用 3. 分成小份保存溶液或缓冲液并在用后丢弃。不用已经在试验室用于其他目的的材料或储存液 4. 留出专门用于分离 RNA 的电泳装置。

　用清洁剂清洗后再用流水冲洗，

　乙醇清洗干燥后加入

　3％ 的 H2O2 。室温 10 分钟后用 DEPC 处理过的水彻底冲洗电泳槽 5. 准备所有的溶液和缓冲液时，使用无

　 RNA 酶的玻璃器皿、 DEPC 处理过的水，用于

　RNA 的化学用品用一次性刮刀或直接敲击瓶底分离。可能的化，用

　 0.1 ％的 DEPC 在 37 ℃处理溶液至少

　1 小时后在 15pis （ 1.05kg/cm2 ）高压蒸汽灭菌 15 分钟 6. 灭菌的玻璃器皿和塑料制品不能有效灭活

　RNA 酶。

　300 ℃烘烤玻璃器皿

　4 小时。用 DEPC 活其他灭活基于接触的 RNA 酶的商业化产品处理塑料制品 7. 用声誉好的厂家证明无

　 RNA 酶的一次性移液器头和微量离心管。

　 为了减少污染的机会，

　当从原包装去除这些小的器皿放在实验室架上时最好用无菌的镊子 8. 在分离 RNA 的过程中用抑制剂以抑制 RNA 酶的活性

　1 注意无酶操作，包括戴手套，口罩， EP 管最好用 DEPC 水泡后高压。

　2 操作迅速，留取标本后尽快液氮冷冻保存或冻后放入 -70 度冰箱保存。

　使用专门处理过的冷冻管，进口的为佳。手套一定要戴，器械高温（ 300 ）消毒，标本液氮保存。

　组织液氮冻存后短时间内提取 RNA ，再将 RNA -70 度保存， 可行吗？ RNA 在-70 度能保存多久？ 另一个问题，组织在 -70 度能保存多久？有个博士说她的组织在 -70 度保存一段时间后抽不出RNA 了，建议一直保存在液氮内。

　RNA 要想保存的时间长，最好保存在甲酰胺里面，用的时候再纯化了使用。或者提取的时候到 用 75 ％乙醇洗涤时停止，将 RNA 沉淀保存在 75 ％乙醇（ DEPC 水配置）里面，放在－ 20 度冰箱，一年应该没有问题。

　要用新鲜的组织 ,至少也是用液氮处理后保存于 -70 度冰箱的组织 .

　对于刚进实验室的研究生可能一片茫然，为了节省大家的时间，向大家介绍一下 RT－ PCR 所需的实验耗材及试剂。

　首先，必须设计目的基因引物和内参照引物 ( 或试剂盒自带）

　。此时，你需下列产品：

　1. DEPC

　用纯水按 0.1% 浓度配制 2. Tip 10ul 200ul 1ml 3.EP Tube （ 1.5ml ）

　4. Tip Box （ 10ul 200ul 1ml ）

　5. EP Box （ 1.5ml ）

　6. PCR Tube （ 200ul 或 500ul ）

　7. PE 手套 将耗材及器皿等放入 DEPC 水中浸泡过夜，第二天高温高压灭菌，烘干，待用。

　购买 Total RNA

　试剂盒先做抽提 RNA 的预实验，也可将抽提样品的 RNA 于低温保存。最好现提现用。

　引物合成好后，就可以做 RT-PCR 啦。

　由于 PCR 的反应条件相对不好掌握， 推荐二步法 RT-PCR 试剂盒 ( 对于新手）

　。可以大大降低试剂盒成本。

　RT-PCR 产物出来后，接下来的工作就是 Agarose

　电泳，需要下列试剂：

　1.Agarose 2.EB 3.DNA Marker 4.Tris.base 5.EDTA 以上所述可根据个人具体情况作相应的调整。希望能给广大战友带来方便。

　最好是新鲜的 ,不就再买只大鼠嘛 ! 另外 , 脑提 RNA 和用细胞提差不多 , 很容易 :取出脑组织后放到研钵里 , 加 RNA 提取试剂 ,( 不用加液氮), 研之 ,不象其它组织 , 脑比较易碎 .

　经 DEPC 处理好的东西如冻存管 ,应先在 70-80 度烤干后，再高压

　 1、塑料制品：

　（包括枪头、 EP 管、匀浆管等）

　先将 DEPC 水从容量瓶中倒入瓷缸中， 将塑料制品逐个浸泡其中， 其中小枪头需要吸管打入 DEPC 水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（ EP 管）

　2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（ DEPC 水泡）（洗净后先泡 1‰ DEPC 过夜，再烤干）

　3、剪刀 可以用 DEPC 处理后 180-200 度干烤 2 小时 我做过大鼠下丘脑组织的 RT-PCR ，在动物房将组织取好先放在 RNa－ free 的 EP 管中，放在冰 盒内，然后再转移到实验室的－ 70°冰箱内，在抽 RNA 的时候，脑组织最好要氯仿抽提两次，这 个是我在别的地方看到的，但是真的很好用，可以改善 RNA 抽提的质量。

　1. 抽提 RNA 都是为了得到其 mRNA ，而 mRNA 和组织的状态密切相关， 因此需要超低温的状态， 一般选择用液氮保存组织。而且去的时候要尽可能的新鲜，动作要快，取后立即放入液氮罐中。

　2. 提取 RNA 前要对脑组织进行研磨，切记要在液氮中进行，也是为了防止 充分，使组织块变小。

　3. 加入 trizol 后要充分吹打开，目的是使组织中的核蛋白体，多糖等与 rna 的降解。研磨要 rna 分离。

　4. 其次是注意外源性的 rna 酶污染，操作全过程要戴口罩，手套。操作速度要快，冰上进行。

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