双抗体夹心ELISA检测方法建立
下面是小编为大家整理的双抗体夹心ELISA检测方法建立,供大家参考。
1. 材料与方法 1.1 检测样品的制备
2C3株抗牛安氏隐孢子虫卵囊壁特异性单抗，其制备和纯化方法参照文献。标准阳性粪便，采自粪栓阳性牛粪；标准阴性粪便，为经3次不同时间采粪便集虫后，抗酸染色卵囊均为阴性的牛粪，交叉反应粪便，为集虫粪检仅球虫或结肠小袋纤毛虫感染而无隐袍子虫感染的牛粪。
1.2. 酶标单克隆抗体的制备，参照文献[2：进行，其克分子比为1．96。
1.3.
被险粪便处理方法：取粪2克加入含0.1％聚山梨酸20及2mmol/L乙二胺四乙酸的磷酸缓冲盐溶液5m1碾碎后过滤备用。
1.4. 双抗夹 心ＥＬＩＳＡ法工作程序 聚乙烯反应板经0.0025％的戊二醛溶液等处理后，使其更易与抗原或抗体结合．置4℃冰箱备用。包被液适当稀释兔抗体(ＩｇＧ),于微量酶标板每孔加100μｌ,置4℃过夜后,用洗涤液洗3次。每孔加待测样品100μｌ,同时设阴性和试剂空白对比,放置37℃反应2ｈ,用洗涤液洗3次。每孔加适当稀释的酶标抗体100μ1置37℃反应2ｈ,用洗涤液洗涤3次。每孔加底物溶液100μｌ,室温暗处放置20ｍｉｎ显色,每孔加中止反应液50μｌ。然后在酶标测定仪上测定490ｎｍ处的ＯＤ值。以样品孔的ＯＤ值(Ｐ)与阴性对比孔的ＯＤ值(Ｎ)之比大于2(即Ｐ/Ｎ>2)时定为阳性。
1.5. 双抗夹心ＥＬＩＳＡ法工作浓度的确定 通过交叉连续稀释分析法确定用于检测肯定浓度抗原所需兔抗体(ＩｇＧ)和酶标抗体的工作浓度。兔抗体(ＩｇＧ)浓度分别为 25ｎｇ/ｍｌ、50ｎｇ/ｍｌ、75ｎｇ/ｍｌ、100ｎｇ/ｍｌ;虫卵浓度分别为 10 7 、10 6 、10 5 、10 4 、10 3 和 10 2 个/ｍｌ。酶标抗体的稀释度分别为1：50、1:100、1:200、1:400、1:800。在工作浓度选择中,以Ｐ/Ｎ>2 时,兔抗体(ＩｇＧ)浓度最低、酶标抗体稀释度最高为最适条件。
1.6. 最佳反应条件确定
经方阵滴定，确定单抗和酶标单抗的员适工作浓度分别为1：400和1280倍比稀释。加入粪样和酶结合物孵育的时间可缩短至3min。除加入酶结合物反应后洗涤5次外，其余洗涤次数均为3次，洗涤时间可结至l0s。
1.7. 阻断试验
将单抗1：100稀释．1m1分装于各试管，将标准阳性粪便悬液从原液稀释至512倍并加入试管内，37℃水浴30 min．60g 离心30 min．除去沉淀物，孵育后的粪便标本进行双抗夹心—ELISA， 1.8. 交叉反应试验 对4份有Eimeria bovis卵囊而无隐袍子虫卵囊的牛粪和5份有而无隐孢子虫卵囊的牛类按前述方法处理后进行ELISA。
1.9. 重复性试验
对相同样品不同批次进行检测。
1.10. 敏感性试验 对若干牛粪样分别进行抗酸染色和ELISA检测，对检测结果进行比较。
2 结果 2.1 抗牛安氏隐孢子虫单抗(ＩｇＧ)和酶标兔抗牛安氏隐孢子虫抗体最佳工作浓度的确定通过点阵分析法,在满意选择条件下,本试验兔抗体(ＩｇＧ)工作浓度为
ｎｇ/ｍｌ,酶标抗体稀释倍数 1:400 是ＥＬＩＳＡ测定方法的最佳工作浓度。
2.2 双抗夹心ＥＬＩＳＡ特性的测定