七叶皂苷钠对大鼠脑出血后脑组织核转录因子和水通道蛋白的作用及相关分析
[摘要] 目的 探讨七叶皂苷钠对急性脑出血（intracerebral hemorrage，ICH）后核转录因子（NF-κB）和水通道蛋白（AQP）动态表达的影响。 方法 选取健康雄性SD大鼠120只，随机分为假手术组、模型组、七叶皂苷钠组（简称治疗组）3组。每组又分为1、2、3和7 d 4个时间点，每个时间点5只大鼠，采用大鼠尾状核注入自体不凝血制备脑出血模型，大鼠分别在不同时间点断头取脑，采用 Western-blot免疫印迹技术观察NF-κB蛋白表达，免疫组化染色观察AQP-4的变化。 结果 治疗组大鼠脑内NF-κB[（0.293±0.067），（0.441±0.064），（0.263±0.068），（0.258±0.061）]、AQP-4蛋白[（11.57±1.98），（14.27±2.16），（16.83±2.34），（9.82±1.64）]表达在不同时间点，与模型组比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。相关性分析两者呈正相关（r = 0. 82，P < 0.05）。 结论 七叶皂苷钠可以抑制脑出血后NF-κB和AQP-4的表达，减轻脑损伤的程度。
[关键词] 脑出血；核转录因子；水通道蛋白4；七叶皂苷钠
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）06（b）-0019-03
脑出血是非外伤性脑实质出血，也是急性脑血管疾病中的急危重症，病死率居急性脑血管病的首位。近来研究显示，脑出血后脑水肿形成可能与免疫炎性反应以及炎症过程中产生的炎症细胞因子有关[1]，而核转录因子（NF-κB）是炎症级联反应的关键物质。脑血肿形成后，脑水肿逐渐加重，促进水通道蛋白4（AQP-4）在脑组织中的表达。本研究旨在观察七叶皂苷钠对脑出血后NF-κB和AQP-4表达的影响探讨其作用机制，为减轻脑出血后水肿提供新的治疗方案[2-3]。
1 材料与方法
1.1 实验动物
清洁级SD大鼠，120只，雄性，体重250～300 g，黑龙江中医药大学实验动物中心提供。标准饲料喂养。SD大鼠随机分为假手术组、脑出血组、七叶皂苷钠治疗组，分别按1、2、3、7 d分为4个亚组，每组5只。
1.2 试剂与仪器
小鼠抗大鼠NF-κB多克隆抗体试剂盒、小鼠抗大鼠AQP-4 单克隆抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司；头颅立体定位仪（Stoelting公司，美国）；微量注射器（宁波市镇江三爱仪器厂）；OLYMPUS光学显微镜（日本）；凝胶图象处理系统（德国）。
1.3 脑出血模型的制备
大鼠脑出血模型采用立体定位钻孔自体血注入法制备。参照Lee等[4]方法进行改良，将大鼠腹腔注射20%乌拉坦（0.30 mg/100 g）麻醉，固定于脑立体定位仪上，皮肤消毒，剥离骨膜，暴露前囟及冠状缝， （以前囟为定位点，向前0.2 mm，中线右旁开3 mm，深6.0 mm），用牙科钻钻直径为1.0 mm的圆孔，用微量注射器抽取右侧股动脉血50 μL，立即于定位仪上沿钻孔进针，以25 μL/min速度推进尾壳核，留针10 min再缓慢出针，缝合切口并局部皮肤用碘酒消毒。假手术组：尾壳核注射生理盐水5 μL。参照Zausinger等[5]评定法进行神经功能评分，4分以下和大鼠出现不同程度的偏瘫症状为模型成功标准。
1.4 治疗方法
造模大鼠苏醒后，治疗组立即给予七叶皂苷钠腹腔注射3 mg/（kg·d），每隔12 h给药1次。假手术组、模型组给药时间及给药途径同治疗组，以等量蒸馏水代替药液。
1.5 脑组织Western blot法检测 NF-κB表达
取血肿周围的100 mg脑组织研磨成粉状，玻璃匀浆器中反复研磨，冰上静置1 h，然后4℃ 12 000 r/min离心20 min，取出上清液Bradford法测定蛋白浓度，-80℃保存用于后续试验。在Tris-甘氨酸缓冲液中电泳，溴酚蓝到达胶的底端附近停止电泳。安装标准电转膜装置，在60 V电压条件下用切好的硝酸纤维素膜进行印迹转移90 min，封闭液封闭，加入小鼠抗大鼠NF-κB（一抗）过夜；次日用TBST在室温下脱色摇床上洗3次；加入二抗稀释液室温下孵育1 h，TBST液清洗3次，DAB显色，β-actin作为内对照利用凝胶成像系统摄像，分析目标带的分子量和积分光密度值，目的蛋白与β-actin积分光密度比值即为目的蛋白的相对表达水平。
1.6 免疫组化方法测定 AQP-4 的表达
采用免疫组化ABC法进行染色，切片常规脱蜡至水，用3%的H2O2孵育15 min。将切片放于枸橼酸缓冲液中修复15 min。PBS清洗3次，滴加兔抗大鼠AQP-4多克隆一抗，4℃冰箱内过夜后，滴加二抗10 μL，DAB 显色5～15 min。苏木精复染细胞核30 s，盐酸酒精分化。封片观察。每个时间点随机取3张切片，在400倍镜下随机选择血肿周围5个不重复的视野，图文处理系统计数阳性细胞，并计算阳性细胞表达率。
1.7 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件包进行统计。计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。相关性分析采用Pearson检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠脑出血后NF-κB蛋白表达情况
三组大鼠不同时间都有NF-κB蛋白表达，治疗组从造模后第1天NF-κB蛋白下调，继之表达增强，高峰出现在第2天时间点，除第2天和第7天外与模型组比较蛋白表达均有所下降，差异有统计学意义（P ﹤ 0.05）。结果见表1。
2.2 大鼠脑出血后脑组织AQP-4免疫组化结果
尾状核区域AQP-4主要表达在血管内皮细胞，假手术组有微弱表达，模型组表达增强，3 d时最明显，与假手术组同期比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）；治疗组各时间点AQP-4蛋白表达与模型组比较，均显著降低（P < 0.05）。结果见表2。
2.3 NF-κB、AQP-4 蛋白表达的相关性
经Pearson相关性分析，NF-κB表达和AQP-4阳性细胞数呈正相关（r =0. 82，P < 0.05）。
3 讨论
脑出血后脑损伤的病理生理机制相当复杂，常伴有不同程度的炎性反应加重脑损伤，已有资料显示，脑出血后血肿周围的炎性反应和细胞死亡的高峰都发生在出血后约48 h，表明脑出血后继发性脑损伤中存在炎性损伤。NF-κB是新近发现的一种功能多样的转录调节因子，通常指p50/p65异源二聚体，调节多种炎症细胞因子的表达[6]，在脑出血后的炎性反应中起关键作用。已有研究证实[7]，脑出血数小时后 NF-κB有表达，促使血肿周围继发性损伤及脑水肿形成。因此，NF-κB与脑出血后脑水肿有关[8]。NF-κB可以诱导多种炎症介质基因的表达同时又被炎性CK激活，所以NF - κB在受损伤或存在大量炎症介质的组织细胞间大量存在，参与调控炎症级联瀑布效应过程中的多种酶基因的表达[9]。本实验结果表明：假手术组大鼠脑内NF-κB蛋白表达较低，模型组血肿周围脑组织中NF-κB蛋白表达高峰出现在第2天。七叶皂苷钠治疗组对NF-κB蛋白表达有显著下调作用。因此，下调脑内NF-κB蛋白表达可能是七叶皂苷钠治疗脑出血的重要机制。
脑出血后水肿是导致脑出血病情恶化的因素之一，水肿可引起颅内压增高，严重时出现脑疝导致死亡。目前，对于颅内脑组织水积聚和消除的分子机制尚不清楚，水通道蛋白是近年来发现的一组与水通透有关的细胞膜转运蛋白，是水分子跨膜转运的分子基础。AQP-4在脑组织中含量最高，主要分布在星形胶质细胞足突膜上，是胶质细胞与血管间的水调节和转运的重要结构基础，与多种原因导致的脑水肿关系密切[10-11]。AQP-4表达异常被认为是脑水肿形成过程中许多因素相互作用的最后关键一环，调控AQP-4表达有利于维持脑组织水代谢平衡。结果提示：假手术组AQP-4阳性细胞有微弱表达，模型组表达增强，3 d时最明显，治疗组各时间点AQP-4蛋白表达均显著降低。七叶皂苷钠能抑制AQP-4的表达。
从实验结果可以看出：对NF-κB与AQP-4蛋白阳性细胞表达情况进行了相关性分析，发现呈正相关，NF-κB在脑出血早期可能通过炎症毒性作用促进AQP-4的表达，继而加重了脑水肿。七叶皂苷钠可能通过早期抑制NF-κB的产生，并进一步减轻脑血肿周围的白细胞聚集和炎症介质的释放，从而减轻了脑出血后水肿程度，预防脑出血后继发性脑损伤的发生。
七叶皂苷钠提取于七叶树科植物“天师栗”的成熟果实“挲罗子”，主要成分含酯键的三萜皂苷，具有良好的抗炎、抗渗出、消肿的作用，临床上应用七叶皂苷钠治疗急性脑出血患者获得明显效果[12-14]。本实验表明七叶皂苷钠通过降低脑出血大鼠脑组织NF-κB和AQP4的表达，减轻出血后继发脑损伤的程度，对脑组织起保护作用。
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（收稿日期：2013-03-29 本文编辑：卫 轲）